Полимеразная цепная реакция и Владивосток

в 6:40, , рубрики: биобезопасность, Биотехнологии, в футболке Umbrella, Владивосток, днк, микробиология, полимераза, полимеразная цепная реакция, пцр, РНК, я прошёл мимо камеры

Полимеразная цепная реакция и Владивосток - 1

В общем, мы тут лазили по Филиппинам и искали хитрые бактерии. Потом поехали в Исландию с химиками, и они рассказали про экспедиции биологов в горы за термофильным бактериями (которые живут около горячих источников) — и оказалось, что вся эта история была нужна для полимеразной цепной реакции. Мне стало дико интересно, какое отношение лаборатория с анализами крови имеет к геотермальному источнику, и сейчас я расскажу вам эту волнующую историю.

Значит, у нас вчера во Владивостоке Роспотребнадзор и Дальневосточный федеральный университет открыли учебный центр по ПЦР. Я сгонял туда вместе с журналистами и нашёл нормальных безумных учёных, которые всё на пальцах объяснили. Потому что именно это они там и будут делать — учить вьетнамцев и китайцев. В основном — учить бороться с биоугрозой.

Итак, что такое ПЦР?

Это история про то, как сделать из одной молекулы ДНК несколько миллионов точно таких же.

Базово — это реакция из трёх шагов: расплетания ДНК на отдельные спирали, потом поиска и маркировки начала и конца нужных участков, затем достраивания маркированных молекул с помощью полимеразы до полных. То есть это такой симулятор репликации ДНК в нашем организме, только делается в пробирке. И чрезвычайно быстро.

То есть режем все ДНК на половинки, находим только половинки от патогена, отмечаем их, затем полимераза строит к размеченным пары. Повторяем. Повторяем.

Современная реакция удваивает количество ДНК в колбе каждые 40 секунд. Точнее, КПД цикла чуть меньше — от 78% до 99%, потому что не всё и не всегда сцепляется в реальном мире.

Зачем это нужно?

Если у вас в крови плавает какой-нибудь патоген, то можно построить реакцию именно под него, которая будет амплифицировать (увеличивать количество) его ДНК. В какой-то момент в вареве их станет столько, что можно будет это заметить. И вот тут робот закричит: «Ага, попался!», и результат попадёт метка «положительно».

В качестве стартера нам достаточно всего 50 штук молекул на миллилитр в общем случае. Для сравнения, у вируса гриппа даже не крови, а в слюне пациента с первыми симптомами — около 10 тысяч штук на миллилитр.

Зачем это ещё нужно?

Можно сколупать буквально пару ДНК с мумии фараона, мамонта или шкуры тигра и секвенировать его геном. То есть реально полностью считать, потому что из ничтожного количества материала для исследования получится очень много молекул ДНК. Отсюда же и применение в судмедэкспертизе — можно установить, кто из умерших королей кому был сыном. Или по паре молекул слюны на месте преступления найти преступника (прямо Гаттака). Или ещё круче — можно реплицировать молекулы с изменениями, и получится управляемый мутагенез. Но последнее сложно.

А ещё ПЦР — это та самая реакция, которая меняет социальное поведение общества. Потому что с помощью неё определяется отцовство — можно выделять только разные участки ДНК и оцениивать, где и что отличается (и насколько), то есть искать близких родственников. Ну или просто секвенировать и оценивать различия.

Но дальше речь про диагностику вирусных и бактериальных инфекций — это самое широкое применение. И учат тут во Владивостоке ему.

Как проходит ПЦР вообще?

Берём материал, например кровь или ещё что. Аккуратно готовим препарат (обычно берётся 1/3 материала, чтобы на случай ошибок в анализе ещё две дозы оставалось в архиве до конца исследования). Препарат смешиваем с тест-системой. В закрытой колбе помещаем этот «супчик» в прибор для проведения реакции.

Дальше начинаются циклы расплетания ДНК, прицепления к ней праймеров и выстраивания с помощью полимеразы полных молекул. Современные методы ПЦР в реальном времени предполагают, что нужные метки накапливаются и светятся. Это круто, потому что не надо открывать пробирку для реакции на выделение нужных ДНК-последовательностей. Когда свечение можно регистрировать, принимается решение о том, что искомые штаммы в материалы были.

Ещё несколько циклов позволяют оценить степень изменения сигнала и построить гипотезу о том, сколько ДНК-молекул было в материале изначально, то есть с достаточной точностью определить концентрацию патогена.

Откуда праймер знает, к чему цепляться?

Праймер — это хреновина, которая «прилипает» к тому, что совпадает с его нуклеотидным кодом. Если вам нужен вирус бешенства, нужно секвенировать его геном (точнее, нас интересует начало и конец ДНК) и записать места с двух сторон молекулы, где нуклеотидные цепочки уникальны. И сделать к ним праймеры. Праймеры прицепятся к половинкам ДНК, а сверху уже начнёт работать полимераза.

К ДНК клеток крови тогда ничего не прицепится, только к бешенству.

Праймеры бешенства будут цепляться только к бешенству. Чтобы диагностировать вашу коровку на бешенство и грипп, понадобится две дозы крови и две разные реакции.

Теперь самое весёлое. Нам не нужны точно начало и конец молекулы ДНК для диагностики. Нам надо просто много узнаваемых участков. То есть на полном геноме, например, птичьего гриппа, надо выделить два уникальных фрагмента — начало копирования и конец копирования. Чтобы между ними было то, что можно однозначно опознать как птичий грипп без ложноположительных и ложноотрицательных сработок.

Дальше в дело вступает математика — надо выделить уникальные для генома места, и так, чтобы они были очень короткими, в идеале — от 15 до 30 нуклеотидов. И чтобы между ними оказалось нужное. Два праймера дают что-то типа хэша от молекулы ДНК, то есть позволяют её описать в 30-60 нуклеотидов.

В эти минимальные достаточные участки для узнавания и прицепляются праймеры. Если они прицепляются к чему-то ещё — это было плохое нацеливание, и точность падает.

Так при чём тут горячие источники?

Дело в том, что реакция идёт при высокой температуре, иначе ДНК не денатурирует. Полимераза при этой температуре обычно ломается. Обычно — потому что конкретно у термофильных бактерий она всё спокойно переживает. Поэтому и были в прошлом веке экспедиции на Камчатку, где геологи искали средства для молекулярной медицины, отстреливаясь от медведей. А в Европе гоняли в Исландию.

Самое смешное в том, что в 1976 и в 1980 году были публикации про полимеразу (наша и американская), но всем показалось это забавным фактом, и практического применения не нашли.

Теперь дальше. Оказывается, Taq-полимераза из Thremus aquaticus работает по протоколу типа Z-modem, то есть без коррекции ошибок. Вообще. Собирает что получится — и сношайтесь там дальше сами. Зато быстро.

Выделили Pfu- и Pwo-полимеразы из архей — они работают с коррекцией ошибок, то есть не дают мутации в процессе репликации (ладно, почти не дают), но зато действуют куда медленнее.

Раньше запасы этой жажи черпали прямо у источников, сейчас полимеразу разводят в лабораториях. И делают хитрую смесь из Pfu, Pwo и Taq — получается молниеносно быстро и относительно правильно.

Как это выглядит в реальном мире

В реальном мире у вас есть коробка тест-систем с интригующей надписью «сифилис», например. Или «грипп». Внутри одной тест-системы — все компоненты для ПЦР, кроме матрицы ДНК, то есть крови пациента. Или другого его куска, где ищется патоген.

Дальше надо смешать кровь и тест-систему, много раз нагреть и остудить под давлением, а катализатор, праймеры, полимераза и вспомогательные компоненты сделают всё сами. На выходе — пробирка с 10 в двенадцатой молекулами ДНК на миллилитр.

А можно сделать на кухне?

В теории. Сам прибор очень простой, вся наукоёмкость в тест-системе — и немного софте, регистрирующем изменение светового сигнала метки. Ещё нужна точность по температуре от 0,1 градуса и программы по её изменению. Плюс фотосенсор. То есть железо не очень сложное. Поэтому этих лабораторий так много — их реально дёшево разворачивать.

Полимеразная цепная реакция и Владивосток - 2

Полимеразная цепная реакция и Владивосток - 3

Но вот на кухне сделать не выйдет, потому что самая стрёмная история — это контаминация образца (загрязнение). Протоколы чистоты — это то, чему обучают больше, чем самой реакции. Если одна из результирующих пробирок с ДНК патогена разобьётся в лаборатории, всё будет покрыто ровным слоем ложноположительного результата. То есть все текущие анализы — сразу лесом, потом долгая очистка, проверка, потом доставание архивной крови и снова запуск линии.

Ну и это, напоминаю, что ДНК патогена и сам патоген — это разные вещи, как исходник и скомпилированный код. И опасность от того, что вы разбили пробирку с 10 в двенадцатой ДНК вируса турберкулёза примерно такая же, как рассыпать по полу пачку листов исходника софта запуска ядерной боеголовки.

4-7% результатов могут быть ложноположительными из-за неаккуратной работы и особенностей реального мира. Поэтому выполняется тщательная проверка достоверности результата, в частности, с помощью математических методов.

Полимеразная цепная реакция и Владивосток - 4

Ещё вместе с обычными материалами ПЦР подвергают тестовую пробирку с водой. Если там что-то начинает амплифицироваться — лаборанту оторвут руки по самые гланды.

Полимеразная цепная реакция и Владивосток - 5
Это не сейф, это шлюз для передачи материала в лабораторию. Персонал в лабораторию передают в чистую зону после душа, переодевания и ещё пары унижающих человеческое достоинство процедур.

Как можно понять, что с реакцией что-то не так?

По характеру её развития. Обычная реакция начинается вяло, потом фаза экспоненциального роста, потом в районе последних циклов — выход на плато. Количество ДНК не увеличивается с новыми циклами по десяткам причин от истощения праймеров до завершения одного из ресурсов, накапливаются пирофосфаты. Плюс рядом в супе плавают половинки ДНК, которые не прореагировали раньше, и лезут обниматься ко всем. В результате можно определить артефакты и нетипичный ход реакции — это уже делает софт для небольшого дата-майнинга. Отечественный, бесплатный, регулярно обновляемый, но не опенсорсный.

А зачем вообще нужно увеличивать количество ДНК в препарате, если всего-то надо совершенствовать методы детекции?

Есть и такой путь развития. Физико-химические методы совершенствуются, но пока недостаточно. Последний опыт — брали плазму крови, центрифугировали, «тяжёлые» вирусы выпадали на дно пробирки. Дальше их поджаривали лазером масспектрографа. Нифига. С колониями бактерий работает (уже давно делают в московских лабораториях на потоке), а вот с вирусами нет. И колонию ещё надо вырастить. Поэтому пока (и, похоже ближайшие лет десять) ПЦР будет самой быстрой штукой для анализов.

Кстати, полный анализ делается примерно 45 минут (с подготовкой материала), то есть полдня cito или 4 дня, если лаборатория в городе, а вы в селе.

Ещё для части инфекционных заболеваний концентрация вируса крайне мала. Например, был случай по энцефалиту — клиницист увидел очаговую симптоматику (поражение ЦНС), взяли кровь — даже по ПЦР ещё ничего нет, а антитела уже развёрнуты. То есть ПЦР дала бы результат позже анализа антител, а масс-спектрография — ещё позже, она пока на порядки менее точна, чем ПЦР.

То есть амплифицируется только один конкретный геном?

В обычном случае — да. Находится самый современный штамм заболевания, актуальный для региона, и праймеры нацеливаются на его ДНК. Но это немножко утопичная ситуация, потому что одновременно надо искать сразу штук шесть разных штаммов. Для этого в набор добавляются разные праймеры, плюс делается ещё ряд изменений. Естественно, тест-система получается дороже. Либо надо делать несколько реакций под разные возбудители.

Можно так размножать РНК?

Да, только нужно из неё делать ДНК. Реакция более сложная, но интересная тем, что позволяет отделять мёртвые клетки от живых. ДНК невероятно прочная, поэтому её можно отколупать даже от мамонта. Если вирус уже перебит, ДНК его дохлых образцов будет «светиться» ещё 3 недели. А РНК рассыпятся куда быстрее. Поэтому NASBA-методы (поиск РНК-вирусов, например) куда точнее в ряде случаев. Но и куда дороже.

Ещё пара красивых штук

Вся история имплементации ПЦР после изобретения теории — это прямо хитрые физико-химические задачи. Например, можно амплифицировать неизвестные участки ДНК. Для этого молекулу режут по известному участку, потом склеивают обрезки. Некоторые переворачиваются, и получаются молекулы с известным кодом в начале и конце. Цепляют праймеры — и на тех, где есть начало и конец, а не один маркер, проводится амлификация.

Очень забавная история с тем, как избежать ненужных шагов реакции при нагреве пробирки. Дело в том, что первая часть реакции идёт при высокой температуре, но пока пробирка греется, можно случайно начать не с того такта — это резко повысит шум и вероятность ошибки. Поэтому от вариантов с тем, что один из реагентов системы кладётся в восковую капсулу (она плавится только после прохода через нужную точку и освобождает компонент вовремя) пришли к варианту, когда в раствор добавляется вещество, которое блокирует реакцию, но разрушается при высокой температуре.

Есть защита от загрязнения — молекулы на амплификации можно маркировать определённым образом, а потом в начале реакции уничтожать все маркированные так. То есть если что-то из одной пробирки переползло в другую, его автоматом завалят до основных реакций.

С флуоресценцией тоже круто: в реагенты кладётся вещество, которое разрушается в результате реакций с ДНК. То есть чем больше ДНК образуется, тем больше молекул этого вещества разламывается. Целое оно не светится, а кусками — начинает. И вот чем больше молекул ДНК реагируют при репликации, тем больше светится пробирка.

С учётом, что сложность тест-систем растёт, лайфхаков и элегантных решений море.

Зачем нужно делать центры обучения ПЦР при университетах?

Потому что это пока главная история про диагностику заболеваний, причём не обязательно у людей. Здесь, на Дальнем Востоке, например, фокус может быть и на фитовирусах. Есть в закромах Родины бинарный вирус спецом для риса (точнее, два хорошо сочетающихся вируса), которые могут взять и положить нафиг весь урожай по Азии при распространении. Естественно, такая штука есть не только у нас — и не обязательно он будет выпущен злонамеренно, может развиться по идиотизму или просто в природном очаге. Как японский энцефалит в Приморье — тут постоянно возникают сезонные очаги у комаров. А смертность от него — 60 процентов.

Ещё у предполагаемого противника есть вирусы на животных и людей.

Так вот, спецы по ПЦР представляют биобезопасность страны. Они мониторят инфекции, вылавливают всех пассажиров самолёта, где кое-кто не тем кашлянул и так далее. Михаил, например, летал на эболу, на оба птичьих гриппа и ещё много куда. Он же секвенировал полный геном единственной живой копии вируса медвежьего бешенства в мире.

Полимеразная цепная реакция и Владивосток - 6
Михаил Щелканов, профессор ДВФУ, завлаб вирусологии ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН.

С медведем вообще офигенная история. Мишка задрал 5 собак и потом напал на бабку. Он ей лёгкое вывернул и скальп снял, плюс обслюнявил всю и залил кровью. Про зверя охотоведы решили, что это какой-то неправильный медведь. И отдали его остатки учёным на опыты. Вот тут больше деталей.

Ещё Михаил фанат морских котиков, потому что обожает острова с лежбищами. На них крайне быстро передаются на всю популяцию вирусы и паразиты. Они нашли у котиков в ноздрях крутую вшу с не менее крутыми бактериями. Тюлень когда ныряет, он ноздри схлопывает. Вша внутри чувствует себя тепло и прельстиво.

Кроме биобезопасности вторая история — обучение иностранных специалистов. Тут две важных вещи: во-первых, они учатся на наших тест-системах (и потом будут с большей вероятностью закупать их), а это важно для экспорта — мы лидеры по СНГ (примерно 25 миллионов реакций в год), но не по миру. Во-вторых, одинаковость опыта позволяет одинаково мониторить по общим протоколам, то есть потом меняться базами данных и опытом. Базами, конечно, важнее. Это означает куда более согласованную реакцию на возможные эпидемии.

Полимеразная цепная реакция и Владивосток - 7
Во Владивостоке официальное открытие не совпало с техническим — уже последние уроки добивает группа вьетнамских врачей. Двое знают русский, остальные учатся через них. Есть полностью английский курс. Такой же центр работает в Новосибирске для российских врачей и врачей из стран СНГ, и там уже год выпускают спецов.

Ещё мы для наших тест-систем сейчас делаем всё в России, и в практической молекулярной биологии одни из самых сильных в мире (в теории — нет, но мы быстро и c инженерно-творчески всё внедряем). Поэтому образование поможет расширять этот рынок для нас же. Всего в таких центрах подготовлен 3881 специалист (маленькие группы, потому что много практики), и сейчас задача широко выйти на обучение зарубежных спецов.

Полностью это называется Международный учебный центр Роспотребнадзора при Школе биомедицины Дальневосточного федерального университета. Открывали его, собственно, Михаил Щелканов с фото выше и Герман Шипулин (ФБУН ЦНИИ Роспотребнадзора в Москве). Пруфы в СМИ будут завтра, видимо.

Автор: Сергей Абдульманов

Источник

* - обязательные к заполнению поля


https://ajax.googleapis.com/ajax/libs/jquery/3.4.1/jquery.min.js